Специфическая диагностика вич инфекции

«АнтиВИЧ/СПИД»

Городская целевая комплексная программа

Московский городской центр профилактики и борьбы со СПИДом

Диагностика ВИЧ-инфекции

В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции используют различные методы обнаружения ВИЧ, антигенов и генного материала ВИЧ, а также методы обнаружения антител к ВИЧ (т. е. вирусологический, молекулярно-генетический (ПЦР) и серологический (ИФА, ИХА, иммунный блот) методы). Стандартной и наиболее доступной процедурой является выявление антител к ВИЧ с помощью наборов реагентов, разрешённых к применению с этой целью в Российской Федерации, с последующим подтверждением специфичности антител в реакции иммунного блоттинга.

В России в настоящее время стандартной процедурой лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к ВИЧ (первый уровень диагностики). При положительной реакции ИФА, ИХА проводят иммунный блоттинг для определения специфичности выявленных антител (второй уровень диагностики). Реакция иммунного блоттинга ставится в лабораторном отделении МГЦ СПИД.

Временной интервал, в течение которого в организме ВИЧ-инфицированного не обнаруживаются антитела, называют периодом «серонегативного окна». Обследование в этот период может дать отрицательный результат даже при наличии высокой концентрации вируса в организме. Таким образом, для того, чтобы быть уверенным в отрицательном результате теста, необходимо повторить исследование крови в ИФА через шесть месяцев после сомнительной «опасной» ситуации, в результате которой могло произойти инфицирование ВИЧ.

Лабораторные анализы являются основным звеном в диагностике ВИЧ-инфекции, а, кроме того, крайне необходимы для своевременного назначения специфического лечения и контроля эффективности проводимой терапии. Постоянное обследование пациентов позволяет контролировать эффективность лечения, выявлять сопутствующие заболевания, отслеживать развитие побочных эффектов.

Регулярное обследование больного по схеме, назначенной лечащим врачом, имеет решающее значение для адекватного подбора комбинаций антиретровирусных препаратов, своевременного отслеживания возможных побочных эффектов, контроля за сопутствующими заболеваниями.

Диагностика ВИЧ

Основным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к вирусу с помощью иммуноферментного анализа. Клинические показания для обследования пациента на ВИЧ-инфекцию следующие: лихорадка более 1 мес, диарея более 1 мес, необъяснимая потеря массы тела на 10% и более, пневмонии затяжные, рецидивирующие или неподдающиеся стандартной терапии, постоянный кашель более 1 мес, затяжные, рецидивирующие вирусные, бактериальные, паразитарные болезни, сепсис, увеличение лимфоузлов двух и более групп свыше 1 мес, подострый энцефалит, слабоумие у ранее здоровых людей и другие, в том числе СПИД-индикаторные болезни.

При обследовании на ВИЧ необходимо учитывать эпиданам-нез. Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% инфицированных в течение 3 мес после заражения, у 5-9% — через 6 мес и у 0,5-1% — в более поздние сроки. В стадии СПИДа содержание антител в крови может существенно снижаться.

Забор крови производят из локтевой вены в чистую сухую пробирку в количестве 3-5 мл. Материал не следует длительно хранить, так как наступивший гемолиз повлияет на результаты анализа. Поэтому после взятия крови желательно отделить сыворотку, которая может храниться в холодильнике до 7 дней.

Метод ИФА является скрининговым. В случае положительного результата анализ в лаборатории проводится дважды (с той же сывороткой) и при получении хотя бы еще одного положительного результата сыворотка направляется для постановки подтверждающего теста.

Для подтверждения специфичности результата, полученного в ИФА, используется иммуноблот, принцип которого заключается в выявлении антител к целому ряду белков вируса.

До получения положительного результата в иммуноблоте и при отрицательном результате человек считается здоровым, противоэпидемические мероприятия не проводят.

Варианты тестирования на ВИЧ:

а) анонимное (имя пациента неизвестно),

б) номинальное (на образце указано имя больного),

в) не номинальное (образцы закодированы, но врач знает имя пациента). О положительных результатах сообщают местным органам здравоохранения.

Для определения прогноза и тяжести ВИЧ-инфекции большое значение имеет определение «вирусной нагрузки» — количества копий РНК ВИЧ в плазме методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Рекомендации по определению вирусной нагрузки (Viral Load):

1. Без лечения — каждые 6-12 мес.

2. На фоне лечения — каждые 3-6 мес.

3. После перенесенной инфекции или вакцинации.

4. Для создания возможности определить подтипы вируса в популяции.

5. При изменении характера терапии.

6. В целях сопоставления с клиническим течением болезни и уровнем С04-лимфоцитов.

Используют и другие маркеры инфекции (белок р24 и др.).

Помимо специфических методов диагностики применяют иммунологические методы, позволяющие определить стадию инфекции. Прежде всего, это определение общего количества лимфоцитов, Т-хелперов (CD4), цитотоксических лимфоцитов (CD8) и соотношения CD4:CD8. Снижение коэффициента С04:С08 до 0,6 и ниже отмечается в стадию СПИДа. Уменьшение количества CD4 до 500 клеток в 1 мм 3 свидетельствует о развивающейся иммуносупрессии.

Диагноз ВИЧ-инфекции устанавливают на основании эпидемиологических, клинических, лабораторных данных, с указанием стадии, расшифровывая подробно вторичные заболевания.

Специфическая диагностика вич инфекции

Обязательные — определение анти-ВИЧ-антител.
— Выявление методом иммуноферментного анализа антител к gpl20, gp41, gpl20/160 и др. Твердофазный ИФА — наиболее распространенный метод лабораторного обнаружения анти-ВИЧ-антител, чувствительность и специфичность которого достигают 99%. Ложноположительные результаты могут быть обусловлены наличием у обследуемого пациента аутоиммунной патологии, беременностью и рядом других причин.
— Определение методом иммуноблота антител к двум и более антигенам ВИЧ. Иммуноблоттинг — качественный метод, позволяющий выявить антитела одновременно к ряду антигенов ВИЧ.

• Дополнительные — определение антигенов ВИЧ. — Определение ВИЧ в лимфоцитах методом ПЦР.
Определение р24-антигена методом ИФА. — Выделение ВИЧ в культуре in vitro. Неспецифические лабораторные маркеры

• Уменьшение количества CD4 Т-клеток.
• Снижение иммунорегуляторного индекса (соотношение CD4+/ CD8 Т-клеток) меньше 1.

Антигенные маркеры ВИЧ выявляются в крови значительно раньше. Так, начиная со 2-й по 8-ю неделю после заражения выявляют белок р24. При получении положительных результатов в тест-системах данного типа нужно провести обследование на антитела к ВИЧ. Одновременное определение анти-ВИЧ-антител и антигенов значительно сокращает период «серонегативного окна».

В России принято 3-этапное выявление антител к ВИЧ. Отрицательный этап скрининговой ИФА-диагностики считают окончательным. Положительный результат ИФА требует двойной проверки с использованием тест-систем другой серии. Дважды отрицательный результат считается окончательным. При повторном положительном результате ИФА необходимо исследование методом иммуноблота на целлюлозной мембране. Обнаружение антител к двум или трем антигенам вируса (основные антигены gp41, gpl20 и их предшественник gpl60) служит основанием для того, чтобы лабораторно подтвердить диагноз ВИЧ-инфекции. Определение в иммуноблоте антител к какому-либо одному белку вируса расценивают как сомнительный результат, что делает необходимым динамический контроль через 3 и 6 мес.

К методам специфической диагностики ВИЧ-инфекции относят также ПЦР. Выявление в 1 мл крови меньше 500 копий вирусной РНК свидетельствует о существенном ограничении инфекционного процесса, от 500 до 99 000 — об умеренной его интенсивности, а выявление 100 000 и больше копий в 1 мл — об активном процессе репликации возбудителя.

ПЦР имеет большое значение, когда тесты на антитела к ВИЧ и антигены дают отрицательный результат, иными словами, в латентный период заболевания. ПЦР можно использовать, например, для установления диагноза у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Материнские антитела циркулируют в крови ребенка до 15-18 мес, а ПЦР позволяет обнаружить ВИЧ уже на 1-м месяце жизни. Кроме того, ПЦР можно использовать, чтобы количественно оценить активность инфекционного процесса по числу вирусных копий РНК (уровень вирусной нагрузки). В разные периоды инфекционного процесса уровни анти-ВИЧ-антител и вирусной нагрузки значительно меняются. Лабораторные методы определения специфических маркеров ВИЧ используются не только для постановки диагноза, но и для оценки активности процесса, прогнозирования течения заболевания, определения объема и эффективности противовирусной терапии.

Достоверный лабораторный признак ВИЧ-инфекции — выделение и идентификация культуры ВИЧ. Однако этот метод требует длительного времени, специального оборудования, высокой квалификации исполнителей и проводится в специализированных лабораториях в сложных для диагностики случаях.

Для оценки степени иммунной недостаточности у больных ВИЧ-инфекцией важно контролировать показатели иммунного статуса. Первостепенное значение имеет определение количества CD4+ Т-лимфоцитов, так как именно они являются основными клетками-мишенями для вируса и именно их повреждение определяет глубину иммуносупрессии.

Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции

диагностика любого инфекционного заболевания основана на сопоставлении эпидемиологических, клинических и лабораторных данных, и преувеличение значения одной из групп этих данных может привести к диагностическим ошибкам.

Клинические показания для обследования пациента на ВИЧ-инфекцию:
•лихорадка более 1 месяца;
•диарея более 1 месяца;
•необъяснимая потеря массы тела на 10% и более;
•затяжные, рецидивирующие или не поддающиеся стандартной терапии пневмонии;
•постоянный кашель более 1 месяца;
•затяжные рецидивирующие вирусные, бактериальные, паразитарные болезни;
•сепсис;
•увеличение лимфоузлов двух и более групп свыше 1 месяца;
•подострый энцефалит;
•слабоумие у ранее здоровых людей;
•наличие СПИД-индикаторных болезней.

Диагностика ВИЧ-инфекции включает в себя два этапа:
I этап — установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией ;
II этап — определение стадии заболевания .

УСТАНОВЛЕНИЕ ФАКТА ЗАРАЖЕННОСТИ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ

Установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией (то есть выявление ВИЧ-инфицированных) в свою очередь также включает в себя два этапа:
I этапиммуноферментный анализ (ИФА) : метод ИФА является скрининговым (отборочным) — отбор предположительно инфицированных лиц, то есть его целью является выявление подозрительных лиц и отсеивние здоровых лиц; антитела к ВИЧ выявляют с помощью других антител к искомым антителам (антитела против других антител). Эти «вспомогательные» антитела метят ферментом. Все скрининговые тесты обязаны быть высокочувствительными, чтобы не пропустить больного. Из-за этого их специфичность не очень высокая, то есть ИФА может дать положительный ответ («вероятно болен») у неинфицированных людей (например, у больных аутоиммунными заболеваниями: ревматизм, системная красная волчанка и др.). Частота ложноположительных результатов при использовании различных тест-систем колеблется от 0,02 до 0,5%. Если у человека ИФА дало положительный результат, то для подтверждения факта инфицирования ВИЧ необходимо обследоваться дальше. При проведении ИФА в 3 — 5% случаев возможны ложноотрицательные результаты — если инфицирование произошло относительно недавно и уровень антител еще очень низкий, или в терминальной стадии болезни, характеризующейся тяжелым поражением иммунной системы с глубоким нарушением процесса антителообразования. Поэтому при наличии данных, свидетельствующих о контакте с инфицированными ВИЧ обычно проводят повторные исследования через 2 — 3 месяца.
II этапиммуноблоттинг (в модификации Western Blot, вестерн-блот) : является более сложным методом и служит для подтверждения факта инфицирования. Этот метод выявляет не комплексные антитела к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (p24, gp120, gp41 и др.). Результаты иммуноблоттинга считаются положительными, если выявляются антитела хотя бы к трем белкам, один из которых кодируется генами env , другой — генами gag , третий — генами pol . Если обнаруживаются антитела к одному или двум белкам, результат считается сомнительным и требует подтверждения. В большинстве лабораторий диагноз ВИЧ-инфекции ставится, если одновременно выявляются антитела к белкам р24 , р31 , gp4l и gpl20/gp160. Суть метода: вирус разрушают на компоненты (антигены), которые состоят из ионизированных аминокислотных остатков, а потому все компоненты имеют отличающийся друг от друга заря; затем с помощью электрофореза (электрического тока) антигены распределяются на поверхности полоски — если в исследуемой сыворотке есть антитела к ВИЧ, то они будут взаимодействовать со всеми группами антигенов, а это можно выявить.

Следует помнить , что антитела к ВИЧ появляются у 90-95% инфицированных в течение 3-х месяцев после заражения, у 5-9% инфицированных антитела к ВИЧ появляются через 6 месяцев и у 0,5-1 % инфицированных антитела к ВИЧ появляются в более поздние сроки. В стадии СПИДа количество антител может снижаться, вплоть до полного исчезновения.

В иммунологии существует такое понятие, как «серологическое окно» — период от инфицирования до появления такого количества антител, которое можно выявить. Для ВИЧ этот период обычно продолжается от 2 до 12 недель, в редких случаях дольше. В период «серологического окна» по анализам человек здоров, но на самом деле является зараженным ВИЧ. Установлено, что ДНК ВИЧ может находиться в геноме человека не менее трех лет без признаков активности и антитела к ВИЧ (маркеры ВИЧ-инфицирования) не появляются.

В данный период («серологическое окно») выявить ВИЧ-инфицированного и даже через 1-2 недели после заражения возможно с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это чрезвычайно чувствительный метод — теоретически можно выявить 1 ДНК на 10 мл среды. Суть метода заключается в следующем: с помощью полимеразной цепной реакции получают много копий нуклеиновой кислоты (вирус является нуклеиновой кислотой -ДНК или РНК — в белковой оболочке), которые потом выявляют с помощью меченых ферментов или изотопов, а также по характерному строению. ПЦР является дорогостоящим методом диагностики, поэтому при скрининге и в плановом порядке не используется.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАДИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ

В основе развития СПИДа лежит , в первую очередь, разрушение Т-лимфоцитов-хелперов, маркируемых моноклональными антителами — кластерами дифференцировки – как CD4. В связи с этим проведение диагностики и наблюдение за прогрессированием заболевания невозможно без контроля субпопуляции Т-хелперов, который наиболее удобно осуществлять с помощью лазерного клеточного сортировщика.

При слабо выраженной ВИЧ-инфекции количество Т-лимфоцитов — чрезвычайно вариабельный показатель. В целом, снижение числа клеток CD4 (абсолютное и относительное) обнаруживается у лиц, ВИЧ-инфицирование которых произошло не менее года назад. С другой стороны, на ранних стадиях инфекции нередко оказывается резко повышенным число Т-супрессоры (CD8) как в периферической крови, так и в увеличенных лимфоузлах.

При выраженном СПИДе абсолютное большинство больных имеет сниженное общее число Т-лимфоцитов (менее 1000 в 1 мкл крови, в том числе лимфоцитов CD4 — менее чем 22 в 1 мкл, тогда как абсолютное значение содержания CD8 остаётся в пределах нормы). Соответственно, резко снижается соотношение CD4/ CD8. Ответ Т-лимфоцитов in vitro на стандартные антигены и митогены снижается в строгом соответствии с относительно сниженным числом CD4.

Для поздних стадии СПИДа характерны общая лимфопения, нейтропения, тромбоцитопения (соответственно, снижение числа лимфоцитов, нейтрофилов и тромбоцитов), анемия. Эти изменения могут быть следствием центрального угнетения кроветворения за счёт поражения кроветворных органов вирусом, а также — аутоиммунного разрушения клеточных субпопуляции на периферии. Кроме того, для СПИДа характерно умеренное увеличение количества гамма-глобулинов с доминирующим увеличением содержания IgG. Больные с выраженными симптомами СПИДа нередко имеют повышенный уровень IgA. На некоторых стадиях заболевания существенно повышается уровень таких маркёров СПИДа, как β1-микроглобулин, кислотостабильный α-интерферон, α1-тимозин. То же происходит с секрецией свободного неоптерина — метаболита макрофагов. Пока не представляется возможным оценить относительную значимость каждого из перечисленных тестов, число которых постоянно возрастает. Поэтому их следует рассматривать во взаимодействии с маркёрами ВИЧ-инфекции как иммуновирусологического, так и цитологического характера. Для клинического анализа крови характерны лейкопения, лимфопения (соответственно, снижение числа лейкоцитов и лимфоцитов).

1 стадия — «стадия инкубации» — антитела к ВИЧ еще не выявляются; диагноз ВИЧ-инфекции на данной стадии ставится на основании эпидемиологических данных и лабораторно должен подтверждаться обнаружением в сыворотке крови пациента вируса иммунодефицита человека, его антигенов, нуклеиновых кислот ВИЧ;
2 стадия — «стадия первичных проявлений» — в данном периоде уже имеется выработка антител:;
2А стадия — «бессимптомная» — ВИЧ-инфекция проявляется только выработкой антител;
2Б стадия — «острая ВИЧ-инфекция без вторичных заболеваний» — в крови больных могут обнаруживаться широкоплазменные лимфоциты — «мононуклеары» и часто отмечается транзиторное снижение уровня СD4-лимфоцитов (острая клиническая инфекция отмечается у 50-90% инфицированных лиц в первые 3 месяца после заражения; начало периода острой инфекции, как правило, опережает сероконверсию, т.е. появление антител к ВИЧ);
2В стадия — «острая ВИЧ-инфекция с вторичными заболеваниями» — на фоне снижения уровня СD4-лимфоцитов и развившегося вследствие этого иммунодефицита появляются вторичные заболевания различной этиологии (ангина, бактериальная и пневмоцистная пневмония, кандидозы, герпетическия инфекция и др.);
3 стадия — «латентная» — в ответ на прогрессирование иммунодефицита происходит модификация иммунного ответа в виде избыточного воспроизводства СD4-клеток с последующим постепенным снижением уровня СD4-лимфоцитов, в среднем со скоростью 0,05-0,07×109/л в год; в крови обнаруживаются антитела к ВИЧ;
4 стадия — «стадия вторичных заболеваний» — истощение лимфоцитов популяции CD4, концентрация антител к вирусу значительно снижается (в зависимости от тяжести вторичных заболеваний выделяют стадии 4А, 4Б, 4В);
5 стадия — «терминальная стадия» — типично снижение количества СD4-клеток ниже 0,05×109/л; концентрация антител к вирусу значительно снижается или антитела могут не определяться.

Специфическая диагностика вич инфекции

2. Серологическая диагностика. В настоящее время получила наибольшее распространение.

Материал для исследования — сыворотка крови.

В серологической диагностике ВИЧ-инфекции на первом этапе используют ИФА со стандартными иммуноферментными диагностическими системами. Метод скрининговый. Принцип метода основан на классическом варианте прямого ИФА. Иммуносорбентом для антигенов ВИЧ являются полистироловые планшеты. В лунки планшет вносят испытуемую сыворотку в разведении и проводят инкубацию. После связывания АГ с АТ планшеты трехкратно отмывают от несвязавшихся белков. После этого в лунки планшет вносят конъюгат — антитела к иммуноглобулинам человека, меченные ферментом. Образование специфического комплекса АГ+АТ выявляют внесением субстрата для фермента (раствор ортофенилендиамина и перекиси водорода). В результате воздействия фермента на субстрат меняется окраска среды пропорционально количеству выявленных в пробе антител. Результаты исследования учитывают на фотометре. Наличие вирусспецифических антител в сыворотке крови в дальнейшем необходимо подтвердить посредством исследования методом иммунного блоттинга.

Иммунный блоттинг — подтверждающий тест, позволяющий выявить и дифференцировать наличие антител к различным белкам ВИЧ. В его основе лежит разделение белков ВИЧ по молекулярной массе методом электрофореза в полиакриламидном геле. В последующем антигены ВИЧ переносят на мембрану из нитроцеллюлозы. Затем нитроцеллюлозные мембраны с антигенами ВИЧ обрабатывают испытуемой сывороткой. При этом вирусспецифические антитела образуют комплекс с конкретным АГ (gp120, gp41, p24, p18). Заключительный этап исследования — выявление комплексов антиген-антитело с различными белками ВИЧ. Для этого в систему добавляют конъюгат — антитела против белков человека, меченные ферментом или радиоизотопной меткой. При этом в местах образования иммунных комплексов фиксируется метка. Таким образом, в сыворотке пациента выявляют (либо не выявляют) вирусспецифические антитела ко всем или к нескольким антигенам ВИЧ.

3. Оценка иммунного статуса. Исследование направлено на выявление:

Еще по теме:

  • Справка на энтеробиоз срок действия для бассейна Как сдать анализ на энтеробиоз и получить справку для бассейна Многие родители с раннего возраста отдают своих детей в разные спортивные секции. Одним из наиболее популярных и полезных хобби для ребенка может стать плавание. Ведь […]
  • Марганцовка как разводить при ветрянке Применение марганцовки при ветрянке у детей Перманганат калия (марганцовка) обладает выраженным антисептическим действием, поэтому широко применяется для обработки раневых поверхностей кожи и слизистых оболочек. При ветрянке […]
  • Толкачев бСфизкультурный заслон орз Толкачев Борис Комментарии ВЕЛИКОЛЕПНЫЙ метод и книга! Все подробно расписано и действительно помогает! Именно по ней меня вылечили в детстве, а сейчас я применяю обливание и массаж по-Толкачеву уже для своего сына. По поводу […]
  • Синдром гомологичной крови это 34. Синдром массивной гемотрансфузии. Цитратная и калиевая интоксикация. Синдром гомологичной крови. Этиология, патогенез, профилактика, лечение. Синдром массивной гемотрансфузии - осложнение является одним из серьезных осложнений […]
  • Ветрянка чем обрабатывать Перекись водорода и сода при ветрянке Нередко пациенты рекомендуют при ветрянке использовать перекись водорода или пищевую соду. Эти народные средства наделены антисептическими свойствами. Сам процесс терапии осуществляется в […]
  • Менингит как его распознать Как распознать и действовать обнаружив менингит Менингит представляет собой очень опасное для человека заболевание, которое вызывает воспаление мягкой оболочки головного мозга. Заболевание носит инфекционный характер, то есть его […]